Preparación PCR

“Utilizamos el CoolBox XT de BioCision para facilitar nuestro trabajo con materiales delicados. Es fácil de usar,  puede ser utilizado en diferentes aplicaciones de enfriamiento, es convenientemente compacto y fácil de mantener limpio” ~ K. Lind TATAA Biocenter.

INTRODUCCIÓN

La reacción de polimerasa en cadena o PCR (acrónimo en inglés de Polimerase Chain Reaction), es una de las técnicas más potentes que se han descubierto. El PCR es una metodología in vitro, donde una secuencia de ADN es amplificada en particular. La técnica se basa en mecanismos de replicación de ADN in vivo, donde la doble hebra de ADN es denaturada a una hebra simple y luego es duplicada, y así el proceso es repetido varias veces hasta obtener múltiples copias. El PCR es extremadamente sensible, y altamente específico debido a la naturaleza exponencial de la reacción, permitiendo producir grandes cantidades del DNA blanco y detectar en forma precisa   pequeñas cantidades de ADN de una secuencia específica.

En general en un protocolo de trabajo de PCR, se incluyen 3 etapas:

  1. 1. Elegir el sustrato blanco: La elección del ADN blanco está determinado por experimentos específicos. Los partidores son diseñados en base a la secuencia de ADN y se prueban en silicio para  verificar la especificidad de la unión.

  1. 2. Configuración del ensayo: Una vez elegido el sustrato a amplificar y la secuencia de los partidores, los componentes básicos que se utilizan para la reacción, son: Polimerasa, MgCl2, dNTPs, partidores de sentido y antisentido, ADN Blanco, buffer de reacción 10X y agua destilada.

  1. 3. Selección de las condiciones del ensayo: Las condiciones del ensayo del PCR,  se definen en base al número de ciclos totales que se van a realizar,  la temperatura y duración específica de cada paso y en cada ciclo. La decisión final de las condiciones a usar, se basan según la cantidad de material de ADN blanco inicial y a cuantas copias de productos de PCR se desean obtener.

Los flujos de trabajo del PCR pueden variar consideradamente, dependiendo de la aplicación, y a menos que se realice un Hot-Start PCR (inicio en caliente), el trabajo se DEBE realizar a 4°C o menos, con el fin de reducir la actividad nucleasa y prevenir la degradación. NOTA: incluso usando un PCR Hot-Start se pueden obtener un rendimiento ineficiente, no hay amplificación o definitivamente la amplificación no es específica: Se ha observado que se puede eliminar el inicio en caliente y se puede adoptar alternativamente un protocolo de pseudo-Hot Start, como por ejemplo un Hot-Start a 4°C. Los productos de BioCision se pueden incorporar dentro de los protocolos de trabajo de PCR estándar en dos pasos claves: en el aislamiento de los ácidos nucleicos/preparación de la  muestra (aislamiento de mRNA en particular para q-PCR y RT-PCR), y en la realización del ensayo de PCR.

AISLAMIENTO DE MUESTRA DE ÁCIDO NUCLEICO

El primer paso en la mayoría de los protocolos de trabajo de PCR es el aislamiento del ADN o ARN de los otros componentes celulares.

Métodos estándar de Cubetas en hielo

15 muestras son depositadas  directamente en el hielo, este es el método más comúnmente usado para mantener las muestras enfriadas durante la extracción de ácidos nucleicos. Con este método, sin embargo las muestras no están organizadas, se puede evidenciar una desigualdad en las temperaturas de las muestras debido al aire encapsulado entre el hielo picado, y un incremento del riesgo de contaminación por microorganismos o nucleasas que se encuentran presentes en el hielo.

Método CoolRack®

Los mismos 15 tubos en un módulo termo-conductor CoolRack M15 que está fabricado de una aleación que permite adaptarse rápida y uniformemente a <4°C cuando se coloca sobre el hielo, el módulo CoolRack permite mantener las muestras en forma organizada y a una temperatura uniforme para todos los tubos. Usando un módulo de CoolRack en hielo, se permite una extracción óptima de ácidos nucleicos, asegurándose la reproducibilidad en el proceso.

Ice-Free CoolBox™ XT Method

Los mismos 15 microtubos están en una estación de trabajo libre de hielo CoolBoxTMXT. Las muestras son mantenidas a una temperatura estable de 1°C por 10 horas con un núcleo interno de enfriamiento que es reutilizable. Los problemas relacionas con el uso del hielo, tales como; la desorganización, las muestras mojadas, el mayor riego de contaminación a causa  microbios o nucleasas y la variabilidad de la temperatura en las muestras son eliminados cuando se utiliza la estación de trabajo CoolBox XT.

ADN: Muchos Kit comerciales sugieren que la temperatura ambiente es adecuada para el aislamiento de ADN. Sin embargo, es bien sabido que puede haber una disminución en el rendimiento y en la mala calidad del ADN obtenido si las muestras son tomadas,  almacenas y manipuladas inadecuadamente. Es altamente recomendable que todas las muestras antes del aislamiento de ADN se mantengan a 4°C en un módulo CoolRack para asegurar la temperatura uniforme y para mantener la integridad del ADN donde requieren que sean almacenadas en hielo, recomendamos que un módulo CoolRack sea usado para asegurar una temperatura uniforme en todos los tubos. Por otra parte, se permite mantener los reactivos en forma organizada para disminuir el riesgo de contaminación con nucleasas.

ARN: En la reacción de PCR se puede utilizar también como material inicial el RNA, sobretodo cuando se requieren hacer análisis cuantitativos relacionados con la transcripción y expresión de  genes que es llamado RT-PCR. En este caso, es necesario realizar una acción previa con la transcriptasa reversa, una enzima que realiza la conversión del RNA a moléculas de DNA. Es importante hacer notar, que el ARNm es significativamente menos termoestable que el ADN, y cuando se trabaja con ARNm, se deberá tener un extremo cuidado en el manejo de la temperatura. Con el fin de analizar con precisión, esta transcripción, es importante extraer ARN de alta calidad, desde las células o tejidos de interés, con la mínima degradación. Mantener las muestras enfriadas (4°C) antes de la extracción de ARN ES REQUERIDA para inhibir la actividad de las ARNasa y así preservar en forma segura el ARN. Hacer click AQUÍ para ver con más detalle el protocolo de aislamiento de ARN de BioCision que se describe con el CoolBoxTM XT y el módulo CoolRack® que pueden ser  incorporados en los protocolos de trabajo de extracción de ARN.

PREPARACIÓN DEL ENSAYO DE PCR

Es importante que todos los reactivos sean mantenidos a 4°C durante el desarrollo del ensayo. Los partidores de PCR son especialmente sensibles a la temperatura una vez que son reconstituidos y pueden ser degradados debido a la actividad 3´a 5´ exonucleasa de la ADN Polimerasa. Adicionalmente, los dNTPs pueden ser sensibles a los múltiples ciclos de congelamiento/descongelamiento.

Snap freezing in dry ice

Métodos estándar – Directamente en hielo

Esta imagen muestra un típico recipiente lleno de hielo, donde se colocan directamente las muestras  y tubos con reactivos de PCR. Este método es lo que comúnmente se utiliza para mantener las muestras enfriadas, pero que sin embargo, resulta ser muy desorganizado, y que proporciona una alta variabilidad y desigualdad en la distribución de la temperatura, debido a las cavidades de aire que se introducen en el hielo picado, y donde además se produce un mayor riesgo de contaminación de las muestras o reactivos, por  nucleasas y/o microbios presentes en el hielo.

Snap freezing in dry ice using a CoolRack

Método CoolRack®

La microplaca de 96 pocillos está inserta en un módulo CoolRack PCR96 y los microtubos en un módulo CoolRack M6. Estos módulos han sido fabricados con una aleación altamente termo-conductible, que se adapta rápidamente a la temperatura del hielo (<4°C en 60-90 segundos) y mantiene a todos los tubos y pocillos uniformemente a la misma temperatura (con una variación de +/- 0.1°C). Estos módulos permiten además proporcionar una base estable, organizar adecuadamente las muestras y en estado seco. Muchos protocolos de PCR que han usado estos módulos han demostrado significativamente mejoras  en la reproducibilidad de los resultados.

Snap freezing in dry ice using a CoolRack


Método CoolBox XT Libre de Hielo

Las placas de PCR y microtubos son mantenidos en forma refrigerada a 1 °C por más de 10 horas en una estación de trabajo libre de hielo CoolBoxTM gracias a un núcleo de enfriamiento reutilizable que utiliza el sistema, sin baterías de por medio. Los problemas asociados con el uso del hielo, tales como la desorganización, a que las muestras se mantengan mojadas, el alto riesgo de contaminación por microbios y/o nucleasas y una variable temperatura de las muestras y reactivos es eliminada cuando se usa una estación de trabajo CoolBox XT en su protocolo de trabajo.

NOTA: la consistencia en la temperatura entre pocillos es aún más crítica  que en cualquier tipo de experimento cuantitativo, donde la cantidad de ARN en un pocillo es comparado con la cantidad de ARN en otro pocillo. Cualquier  diferencia de temperaturas a lo largo de los platillos de reacción durante la configuración del experimento, puede introducir variaciones que pueden afectar fundamentalmente las diferencias significativas que subyacen en las muestras que  están siendo  medidas.

ELIMINACION DEL HIELO DESDE EL ESTRATO SUPERIOR DE LA REFRIGERACIÓN DE MUESTRAS

Sistemas de trabajo CoolBox XT Libre de Hielo provee una inigualable alternativa de enfriamiento basado en hielo. CoolBox XT no requiere electricidad o baterías. Pero a través del uso de un cartucho de enfriamiento interno, el XT núcleo de enfriamiento, las muestras pueden ser mantenidas uniformemente y reproducibles enfriamientos (0,5 a 4°C) por un minimo de 10 horas hasta 16 horas. Y, el díselo compacto toma la mitad de espacio de un rectángulo convencional de bandeja de hielo, salvando un precioso espacio.

CoolBox XT es fácil de armar y usar. Simplemente se guarda el núcleo XT de enfriamiento en el -20°C del freezer y se inserta en la base del CoolBox XT cuando se esté listo para trabajar. Coloque a temperatura ambiente (o pre-enfriado, como preferencia) el módulo de tubos CoolRack o un módulo de platillos CoolSink sobre un núcleo de enfriamiento XT y permite a modulos de muestras equilibrarse a <4°C. luego inserten sus tubos o platillo de muestras en el módulo de muestras CoolBox XT, que las mantendrá frio por horas.

• Mantiene muestras frías sobre 16 horas con la tapa puesta, y 10 horas sin esta.

• Partes magnetizadas para un fácil ensamblaje y un seguro manejo.

• Núcleo de enfriamiento XT cuenta con un indicador de temperatura LCD para una garantía visual de temperatura.

• Fácil de limpiar y esterilizar con solución de lejía o alcohol.

• Ideal para el uso en campana de cultivo celular u otra área donde el hielo está prohibido o de una importante grado de contaminación.

Rendimiento CoolBox XT

(Izq) Tubos de microcentrífuga en un recipiente de trabajo CoolBox XT Libre de hielo. Las muestras se mantienen uniformes alrededor de 1°C sobre las 10 horas con la tapa abierta, (Centro), y por sobre las 16 horas con la taba puesta (Der).